양식업은 지속 가능한 식량 생산에 중요한 역할을 하며, 전 세계인이 소비할 수 있는 귀중한 제품을 제공합니다 .1 지구 온난화가 수온, 해양 생물 다양성, 수생 식물에 미치는 영향이 커짐에 따라 양식업 관행을 개선해야 할 필요성이 더욱 커지고 있습니다 .2 양식종 중에서  태평양 흰 새우로 흔히 알려진 Litopenaeus vannamei 는 보리새우과(Penaeidae)에서 가장 중요한 양식종입니다. 높은 상업적 가치, 뛰어난 번식 능력, 3 다양한 염분에 대한 적응력, 그리고 특정 병원균이 없는(SPF) 친어의 가용성이 결합되어 전 세계 새우 양식업에서 우점종이 되었습니다.3 결과적으로 새우 양식은 해안 지역의 주요 식량 생산 방식으로 부상하여 경제 성장을 촉진 하고 소규모 기업 활동을 촉진하고 있습니다 .

흰다리새우 양식 의 지속가능성은   세균성 질병 발생을 비롯한 다양한 요인으로 인해 심각한 위협을 받고 있습니다. 집약화, 최적이 아닌 수질, 그리고 다양한 생산 단계에 걸친 영양실조는 이 문제를 더욱 악화시켜 전 세계 산업에 부정적인 영향을 미치고 있습니다 .7 , 8

영어: 해양, 하구 및 해안 환경에 널리 퍼져 있는 그람 음성 호염균인 Vibrio parahaemolyticus 는 전 세계적으로 상당한 사망률과 상당한 경제적 손실을 유발하는 주요 문제입니다 .9 , 10. 박테리아 감염 관리를 위해 항생제에 의존하는 집약적 양식업은 심각한 문제를 제기합니다. 질병 관리에 필수적이지만 광범위한 항생제 사용은 약물 내성 박테리아를 촉진하여 향후 치료 효능을 저하시킵니다. 게다가 투여되는 항생제의 대부분(70~80%)은 환경을 오염시켜 생태계와 수생 생물에 악영향을 미칩니다 .11 , 12 결과적으로 질병 관리를 위해 면역력과 생산성을 향상시키고 항생제의 한계를 극복할 수 있는 지속 가능하고 환경 친화적인 생리 활성 물질에 대한 필요성이 커지고 있습니다 .13 .

자연은 미세조류, 허브 추출물 및 오일, 프로바이오틱스, 균류와 같이 양식업을 위한 다양한 질병 완화 전략을 제공합니다. 그러나 꿀벌 제품은 최근 유망한 대안으로 상당한 주목을 받았습니다. 꿀벌 유래 화합물이 어류의 박테리아성 질병을 치료할 수 있는 잠재력이 있다는 제안을 바탕으로 14  연구자들은 양식업 환경에서 로얄 젤리, 프로폴리스, 꽃가루의 유용성을 조사하기 시작했습니다 15 . 벌독(BV) 또는 아피톡신은 꿀벌(Apidae과)이 침과 연결된 특수한 샘에서 생성하는 복잡한 생물독소입니다 16 . 주로 포식자에 대한 방어 메커니즘이지만 17 BV는 항염증, 항돌연변이, 항균, 방사선 보호, 진통, 면역 자극, 간 보호 및 항암 효과를 포함한 광범위한 약리학적 작용을 나타냅니다 18 , 19 , 20 . 특히, BV는 여러 어류 병원균에 대해 항균 활성을 보였으며, 21 , 22 , 식이 보충제 섭취는 씬립 숭어(  Chelon ramada) 의 성장 성능을 유의미하게 향상시켰습니다. 23 BV는 개별적인 이점 외에도, 벌 군집 내 사회적 방부 및 집단 면역에도 기여합니다.

천연 화합물인 키토산은 유망하고 환경 친화적인 사료 첨가제로 널리 알려져 있으며, 양식업, 농업, 의학, 식품 및 화학 산업 전반에 걸쳐 활용되고 있습니다 .24 이러한 키토산의 유용성은 다양한 분야의 약물 전달 시스템에도 적용됩니다 .25 양식업에서 어류 사료에 키토산을 보충하면 성장, 면역 기능 및 항산화 상태가 크게 향상되었습니다 .26 그러나 키토산과 BV의 나노 접합은 아직 상대적으로 미개척 분야입니다. 키토산과 같은 고분자를 약물 전달체로 사용하면 양식업에서 새로운 접근법을 제시하여 천연 화합물 의 안정성, 효능 및 수용성을 향상시킬 수 있습니다 .27

BV는 인간의 염증 관련 질병을 치료하기 위한 보완 의학에 응용되고 28 다양한 출처의 박테리아에 대한 항균 효과가 연구되었지만 29 , 30 천연 또는 나노입자 형태인지 여부에 관계없이 새우 양식에서의 사용은 아직 탐구되지 않았습니다. 우리가 아는 한, 이 연구는 새우 사료에 나노 영양소로서 벌독의 식이 결합을 평가하고 영양 및 치료 보충제로서의 잠재력을 조사한 최초의 연구입니다. 결과적으로 이 연구는 태평양 흰 새우(Litopenaeus vannamei)의 건강에 대한 새로운 성장 촉진제로서 식이 벌독이 적재된 키토산 나노입자(BV-CSNP)의 영향을 종합적으로 평가하는 것을 목표로 했습니다. 이 조사에는 성장 매개변수, 전신 구성, 비특이적 면역 지표, 항산화제 및 면역 관련 유전자의 전사 발현, 장기 조직학 및  V. parahaemolyticus  도전에 대한 질병 저항성 평가가 포함되었습니다.

벌독과 키토산의 공급원

Hermetia illucens (AMININS Co., Egypt) 에서 채취한 신선한 껍질을   증류수로 세척한 후, 70°C 오븐에서 36시간 동안 건조시켰다. 건조 후, 블렌더를 사용하여 껍질을 분쇄하고, 실온에 보관하여 추후 사용을 완료하였다. 키토산 생산은 껍질에 느슨하게 결합된 단백질을 제거하기 위한 전처리 과정으로 시작하였다. 껍질 100g을 0.05M 아세트산 용액(Sigma-Aldrich Co., USA)에 24시간 동안 담근 후, 증류수(DW)로 세척하고 70°C 오븐에서 4시간 동안 건조시켰다. 다음 단계인 단백질 제거는 단백질과 당을 용해하는 과정이다. 전처리된 분말을 12.5M NaOH 용액(껍질 1:용액 15 비율, w/v)에 2시간 동안 담가 자석 교반을 유지한 후, 실온에서 30분간 냉각시켰다. 다음으로, 탈회는 껍질을 여과하고, 잔류물을 중성 pH가 될 때까지 DW로 세척하고, 다시 건조하는 것을 수반했습니다. 그런 다음, 생성된 분말을 1L의 1% HCl로 24시간 동안 처리했습니다. 여과 후, 잔류물을 중성 pH가 될 때까지 DW로 세척하고 오븐에서 70°C에서 4시간 동안 건조했습니다. 마지막 단계인 탈아세틸화는 키틴 구조에서 아세틸기를 부분적으로 제거했습니다. 이 공정에는 50% NaOH 용액(껍질 1부, 용액 10부 w/v)을 첨가하고 100°C에서 6시간 동안 자기적으로 교반하는 것이 포함되었습니다. 그런 다음 샘플을 실온으로 냉각하고 여과한 다음 중성 pH가 될 때까지 DW로 세척하고 오븐에서 70°C에서 건조했습니다. 생성된 물질은 키토산 31 , 32 였습니다 .

벌독이 함유된 키토산 나노입자(BV-CS NP) 합성

키토산 나노입자(CSNP)는 이온성 겔화법 33을 사용하여 제조하였다 . 먼저, 키토산 0.3g을 1% 아세트산(DW) 100mL에 녹이고, 투명한 용액이 얻어질 때까지 실온에서 자기 교반하였다. 키토산 용액의 pH를 1M NaOH로 5로 조정하였다. 동시에, TPP(Sigma-Aldrich Co., USA) 0.1g을 DW 33.3mL에 녹여 트리폴리인산나트륨(TPP) 용액을 제조하였다. 이 TPP 용액을 실온에서 1000rpm으로 자기 교반하면서 키토산 용액에 적하하여 키토산:TPP 비율을 3:1(v/v)로 유지하였다. 초음파 처리는 20분간 수행하였다. 생성된 키토산 입자 현탁액을 냉각하고 12,000 rpm에서 60분간 원심분리한 후 동결건조하여 4°C에 보관했습니다. 봉독이 함유된 나노입자의 경우, 0.1 g의 꿀벌독(이집트 기자 식물보호연구소 꿀벌연구부에서 구입)을  키토산 용액에 첨가하기 전에 TPP 용액에 첨가했습니다  . 마지막으로, 혼합물을 11,000 rpm에서 4°C에서 60분간 원심분리하고 동결건조하여 4°C에 보관했습니다. 사용된 모든 화학물질과 용매는 분석 등급의 고순도 제품이었습니다.

BV-CSNP의 특성화

CSNP와 BV-CSNP(조합)의 형태를 확인했습니다. TEM 분석을 위해 각 시료 한 방울을 탄소 코팅 구리 격자 위에 놓고 실온에서 건조했습니다. 전자현미경 사진은 알아즈하르 대학교 균류 및 생명공학 지역 센터(RCMB)에서 80kV로 작동하는 JEOL JEM-1010 투과전자현미경을 사용하여 촬영했습니다 . 34

새우와 양식 조건

2주간의 적응 후,   평균 초기 체중이 6.00 ± 0.02 g인 건강한 L. vannamei 240마리를 무작위로 선택하여 1m 3  하파(하파당 새우 20마리)에 4개의 3중 그룹으로 균일하게 분배했습니다. 이 실험은 이집트 다미에타의 개인 흙 연못 새우 농장에서 진행되었습니다. 실험 기간 내내 새우 사육 조건은 다음과 같은 수질 매개변수를 유지했습니다. 용존 산소 6.60 ± 0.03 mg/L, pH 8.16 ± 0.01, 염도 37.50 ± 0.04 g/L, 암모니아 질소 함량 1.22 ± 0.01 mg/L, 독성 암모니아 0.13 ± 0.00, 온도 27.13 ± 0.07 °C. 새우는 체중의 5%를 매일 먹이로 주었고, 사육수의 15%는 매일 교체했습니다.

식단 준비 및 수유 프로토콜

• 이 실험적 식단의 영양 성분과 화학적 조성은 표  1 에 자세히 나와 있습니다 . 우리는 상업용 새우 식단(Skretting Company, Egypt ® )에 다양한 보충제를 완전히 섞어 실험적 식단을 준비했습니다. 키토산 나노입자(CS NP)는 확립된 프로토콜 26 에 따라 식단 1kg당 1g의 농도로 통합되었습니다 . 그런 다음 벌독이 함유된 키토산 나노입자(BV-CSNP)를 상업용 식단에 식단 1kg당 0.1, 0.2, 0.3mg의 세 가지 농도로 첨가했습니다. 대조군은 보충제 없이 기초 상업용 식단만 섭취했습니다. 새우는 63일 동안 매일 3번 오전 8시, 오후 12시, 오후 4시에 이 식단을 먹었습니다. 일일 먹이 공급률은 총 체중의 5%로 유지했습니다.

성장 성과

성장 특성을 평가하기 위해, 각 군에서 새우 20마리씩을 사료 급여 후 63일 전후에 체중을 측정했습니다. 사료 전환율(FCR), 최종 체중(FW), 비성장률(SGR), 그리고 증체량(WG)은 다음 공식을 사용하여 계산했습니다.

• WG (%) = (최종 중량(g)-초기 중량(g))/(초기 중량(g)) ×100.

• SGR=(ln FW - ln IW)/(t)×100.

여기서: ln은 FBW와 IBW의 자연로그이고, t = 시간(일)입니다.

• FCR = (사료 섭취량(g))/(체중 증가량(g)).

새우 체성분 분석

새우 몸체 시료( n = 3)를 기존 방법 35을  사용하여 근접 성분을 평가했습니다 .  붕산으로 NH3를 포집하는 킬달법을 사용하여 조단백질(N × 6.25)을 계산했습니다 . 건물 중량  은 시료를 105°C 오븐에서 건조하여 평가했습니다. 회분 농도는 시료 2g을 550°C의 머플로에서 4시간 동안 연소시켜 측정했습니다. Soxtect System HT 추출 장치는 에테르를 사용하여 총 지질을 추출했습니다. 또한, Schimadzu CA-4P 봄베 열량계 36을 사용하여 총 에너지를 측정했습니다 .