꿀벌( Apis mellifera )의 독은 독샘에서 생성되어 독낭에 저장됩니다. 벌이 침을 쏘면 침은 뒤쪽을 향한 가시로 조직에 고정되고 1 , 2  , 근육의 움직임에 의해 독관을 통해 희생자에게 주입됩니다. 근육의 움직임은 복부 끝의 신경절에 의해 조절됩니다 3 , 4 . 독은 무색, 무취의 산성 pH(4.5~5.5) 액체이며 광범위한 생물학적 활성 물질/독소를 함유하고 있습니다: 펩타이드(예: 멜리틴, 아파민, 비만세포 탈과립 펩타이드, 테르티아핀), 단백질(효소)(예: 인지질분해효소, 히알루로니다제, 인산가수분해효소), 생물학적 아민(히스타민, 도파민, 노르아드레날린, 세로토닌), 아미노산, 당(포도당과 과당), 미네랄 및 휘발성 물질 4 , 5 , 6 .

벌독 독소는 피해자의 신체에서 다양한 생리적 및 생화학적 반응을 유발합니다. 이러한 효과는 복합되어 독의 전반적인 효과를 증가시키고 통증, 발적, 부기 및 가려움증과 같은 전형적인 주사 부위 증상으로 나타납니다. 이 기본적인 독성은 멜리틴, 포스포리파아제, 히알루로니다아제 및 생체 아민과 관련된 일련의 사건으로 인해 발생합니다. 멜리틴과 포스포리파아제는 세포막 인지질을 절단하여 피해자의 세포를 손상시키고 파괴하는 반면 7 , 8 히알루로니다아제는 세포 사이에 틈을 만들어 독이 조직을 통해 더 빨리 이동할 수 있도록 합니다 9. 생체 아민(독에 존재하고 손상된 조직에서 분비됨)은 심장 활동을 증가시켜 독이 몸 전체에 더 빨리 분포되고 모세혈관 투과성(부기)을 증가시키고 면역 반응(염증)을 자극하며 주사 통증을 증가시킵니다 10 , 11 . 독의 다른 성분들(아파민, 비만세포 탈과립 펩타이드, 테르티아핀, 카디오펩)은 이러한 기본적인 효과를 뒷받침합니다 . 12 또한, 봉독은 신경계 13 , 14 , 근육계 15 , 면역계 16  , 신장계 17 , 18 에도 영향을 미칩니다 .

벌독은 벌을 포함한 곤충에 영향을 미치는 것으로도 기록되어 있습니다.벌이 처음 지구에 나타났을 때(1억 2천만~1억 3천만 년 전) 포유류와 조류가 주요 동물 그룹이 아니었던 것은 당연합니다 .19 , 20. 최근에 미국바퀴벌레인  Periplaneta americana 21  와 불벌레인  Pyrrhocoris apterus 22 의 두 가지 곤충 모델 종을 사용하여 벌독의 효과를 모니터링했습니다 .결과에 따르면 독침 투여 후 흉부 근육의 미세 구조와 혈림프의 비텔로게닌 및 영양소 수준의 변화를 포함하여 신체 기능에 상당한 변화가 나타났습니다.게다가 독 치료는 두 실험 종 모두의 중추 신경계(CNS)에서 지방 운동 호르몬(AKH) 수치를 증가시켜 이 호르몬이 곤충 신체의 보호적 항스트레스 메커니즘에서 중요한 역할을 한다는 것을 나타냅니다 .21 , 22 . AKH는 곤충의 뇌 근처에 위치한 작은 내분비선인 심체( corpora cardiaca) 에서 생성되는 펩타이드 신경호르몬입니다  . AKH는 주로 에너지 대사 조절을 통해 곤충의 항스트레스 반응을 활성화하고 항상성을 유지합니다. 23 하지만 신경 신호 전달, 근육 긴장도, 전반적인 운동, 심장 박동, 소화 과정, 면역 체계, 항산화 방어 전략 등 다양한 활동에도 영향을 미칩니다 . 24 , 25 AKH 수치는 곤충의 스트레스 상태를 나타내는 훌륭한 지표 역할을 합니다 .

본 연구에서는 초파리  (Drosophila melanogaster) 를  모델 종으로 사용하여 꿀벌(AM) 독이 곤충 모델에 미치는 영향을 평가했습니다. 초파리는 이론적 관점뿐만 아니라 실제 적용 측면에서도 독침 및 기타 스트레스 요인에 대한 호르몬 조절 방어 전략을 연구하는 데 적합한 종입니다. 26 . 또한 Drome-AKH는 광범위하게 연구되었습니다. 이것은 79개 아미노산 길이의 호르몬 전구체를 인코딩합니다. 이 전구체는 상업적으로 쉽게 합성되는 활성 AKH 옥타펩타이드(pGlu-Leu-Thr-Phe-Ser-Pro-Asp-Trp-NH 2 ) 27 를 포함합니다  . AKH는 곤충 호르몬이지만 최근 연구에서 포유류에서도 활성이 있음이 밝혀졌습니다. 연구에 따르면 마우스에 AKH를 주사하면 운동 활동이 향상되고 신경 변성이 억제되며 우울증과 불안이 감소하고 다양한 신경계 질환에 대한 치료적 잠재력이 있는 것으로 나타났습니다 . 28 , 29 포유류에서 곤충 AKH의 활동은 두 가지 주요 요인으로 설명할 수 있습니다. (1) 곤충의 AKH 신호 전달은 척추동물의 생식선자극호르몬 방출 호르몬 수용체(수용체 하위 그룹 A30의 구성원)와 구조적으로 관련된 G-단백질 결합 수용체에 의해 매개됩니다. ( 2) AKH 분자는 포유류 시스템에 주입될 때 면역원성이 없습니다(Kodrík, 미공개 관찰).

이 연구의 주요 목적은 분자적, 생화학적, 생리학적, 초미세 구조적 마커를 사용하여 AM 독 중독에 대한 방어 메커니즘을 밝히는 것이었습니다.

모델 생물체 및 기관 배양

과일파리 종인  D. melanogaster  (w 1118  균주)는 확립된 초파리 유지 관리 프로토콜(25°C에서 12시간 낮/12시간 어둠 주기)에 따라 표준 옥수수가루-효모-한천 배지에서 유지되었습니다.

실험을 위해 7일 된 암컷 파리를 CO2를 사용하여 마취시키고 튜브 에 수집한 다음 깨어나지 않도록 얼음에 두었습니다.초파리 흉부(근육 조직)는 머리, 복부, 날개, 다리 및 내장을 제거하여 여과된 링거 식염수에서 해부했습니다.마찬가지로, 머리(CNS 조직)는 구기를 제거하여 신경 조직이 노출된 머리 캡슐을 만들었습니다.해부된 조직(흉부 근육 또는 CNS 조직)을 함께 모으고 1% 항생제 혼합물(10,000 U/mL 페니실린 – 10 mg/mL 스트렙토마이신; Sigma-Aldrich)이 포함된 Schneider's Insect Medium(Sigma-Aldrich, MO, USA)에서 세척한 다음 장기 배양 과정에 사용했습니다(자세한 내용은 장기 배양 절 참조).

AM 독과 드롬-AKH

실험에 사용된 AM 독은 체코 공화국 팔라츠키 대학교 올로모우츠 캠퍼스의 J. 다니흘리크 박사님께서 기증해 주셨습니다. 이 독은 일벌로부터 전기 자극을 통해 대량으로 채취했습니다. 다양한 독 샘플의 단백질 독소를 표준화하기 위해, 31 에 기술된 바와 같이 비신코닌산 분석법을 사용하여 단백질 함량을 측정했습니다. 21 에 근거하여 , 배양 웰당 33.3µg의 독 단백질 당량이 흉부 근육 또는 중추신경계 조직에서 AM 독의 효과를 시험하기에 최적의 용량으로 확인되었습니다(자세한 내용은 "장기 배양" 절 참조). 해당 독 분취량은 사용하기 전까지 -80°C에 보관했습니다.

D.  melanogaster  AKH Drome-AKH 27은  Vidia 회사(체코 프라하)에서 상업적으로 합성되었습니다.

장기 배양

장기 배양은 70% 에탄올과 자외선으로 살균한 멸균 유동 상자에서 수행했습니다.해부된 흉부 근육(웰당 흉부 5개) 또는 CNS(웰당 머리 15개) 조직을 신선하고 멸균된 Schneider's 곤충 배지(Sigma-Aldrich)에 넣고 1% 항생제 혼합물(10.000 U/mL 페니실린 - 10 mg/mL 스트렙토마이신; Sigma-Aldrich)을 96웰 F-베이스 배양 플레이트(TPP ® )에 넣었습니다.웰당 총 용량은 125 µL였습니다. 테스트 물질은 다음과 같이 첨가했습니다: Drome-AKH( 32 에 따라 25 pmol ), AM 독(단백질 당 33.3 µg), Drome-AKH와 AM 독의 조합(25 pmol + 단백질 당 33.3 µg). 이 용량은 흉부 근육 또는 머리 부위에 각각 5 pmol Drome-AKH 및/또는 6.66 µg 단백질 독소, 또는 1.66 pmol Drome-AKH 및/또는 2.22 µg 단백질 독소에 해당합니다. 대조군은 배지에서만 배양한 장기를 포함했고, 오염 대조군은 AM 독과 Drome-AKH를 함유한 배지를 사용했지만 조직은 포함하지 않았습니다. 배양은 25°C에서 24시간 동안 진행한 후, 시료를 후속 분석을 위해 -80°C에서 동결하거나 전자현미경 검사를 위해 고정액에 옮겼습니다(자세한 내용은 "주사 및 투과 전자현미경을 이용한 미세구조 관찰" 절 참조).

장기 배양 상대 생존력 평가

조직의 상대적 생존력을 평가하기 위해, 장기 배양의 마지막 3시간 동안 10 µL의 alamarBlue™ 세포 생존 시약(Thermo Fisher Scientific, MA, USA)을 배양 웰에 첨가했습니다(자세한 내용은 Sect. 장기 배양 참조). 3시간 배양 기간(총 24시간) 후, 100 µL의 배지를 수집하고 생성된 레조루핀의 형광(λ ex  560 nm/λ em  590 nm)을 Synergy™ 4 Hybrid Microplate Reader(BioTek, VT, USA)를 사용하여 측정했습니다. 결과는 대조군(100%로 간주)과 처리군(AM 독, Drome-AKH 및 Drome-AKH + AM 독)의 차이 백분율로 표현했습니다. 조직이 없는 AM 독과 Drome-AKH가 포함된 배지를 블랭크로 사용했습니다.

중추신경계(CNS)에서 Drome-AKH 수치 측정(경쟁적 ELISA)

24시간 배양 후 배양된 머리를 수집하고(반응당 두 개의 머리), 내인성 Drome-AKH를 80% 메탄올, 초음파 처리 및 원심분리를 사용하여 CNS에서 분리했습니다 .33 Drome-AKH가 포함된 상층액을 진공 농축기에서 증발시키고 생성된 펠릿을 추가 분석이 있을 때까지 -80°C에 보관했습니다. Drome-AKH의 양은 Zemanová 등이 설명한 방법에 따라 경쟁적 효소 결합 면역 흡착 검사(ELISA)를 사용하여 측정했습니다 .34 합성 Drome-AKH의 알려진 희석 시리즈(Vidia, Prague, Czech Republic)를 기준으로 사용하여 실험 샘플에서 Drome-AKH의 양을 정량화했습니다.

시트르산 합성효소 활동

미토콘드리아는 얼음처럼 차가운 분리 완충액(250 mM 수크로스, 1 mM EDTA 및 10 mM Tris-HCl; pH 7.4)을 사용하여 샘플당 배양된 흉부 5개에서 추출한 후, 균질화하고 4 °C에서 10분 동안 600 ×  g 로 차등 원심분리하여  파편과 핵을 침전시키고, 미토콘드리아를 침전시키기 위해 4 °C에서 10분 동안 7,000 ×  g로  원심분리했습니다. 얻어진 미토콘드리아는 인산 완충 식염수(PBS)에 재현탁했습니다. 그런 다음, 제조사의 지침에 따라 Citrate Synthase Activity Assay Kit(Sigma-Aldrich)를 사용하여 기술 복제본(반응당 흉부 당량 2.5개)에서 시트르산 합성효소 활성을 측정했습니다. 결과는 반응의 반응 속도론적 데이터를 사용하여 계산했습니다.

슈퍼옥사이드 디스뮤타아제(SOD) 및 카탈라아제(CAT) 활성 분석

24시간 배양 후(자세한 내용은 "장기 배양" 절 참조), 흉부(근육 조직) 5개 또는 머리(중추신경계 조직) 15개를 균질화하고 6.3 mM EDTA(pH 7)가 포함된 50 mM K-PBS에서 초음파 처리했습니다. 균질물을 4°C에서 15분간 7000 ×  g 로 원심분리한  후 상층액을 새 튜브로 옮겼습니다. SOD 활성은 제조사의 지침에 따라 Superoxide Dismutase Activity Assay Kit(Sigma-Aldrich)를 사용하여 기술 중복으로 평가했으며, SOD(Sigma-Aldrich)의 200~0.001 U/mL 범위의 맞춤 표준 곡선을 사용했습니다. CAT 활성은 제조사의 지침에 따라 Amplex™ Red Catalase Assay Kit(Invitrogen™, Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 기술 중복으로 측정했습니다.

RT-qPCR을 이용한 면역 관련 유전자 발현 측정

6가지 면역 관련 유전자( Keap1 ,  Relish ,  Nox ,  Eiger ,  Gadd45 ,  Domeless )의 발현을 모니터링했습니다. 배양 후, 제조사의 지침에 따라 TriReagent 용액(Sigma-Aldrich)에서 균질화를 통해 흉부 근육 또는 중추 신경계 조직(샘플당 5개의 흉부 또는 15개의 머리, 자세한 내용은 섹션. 장기 배양 참조)에서 총 RNA를 추출했습니다. 분리된 RNA를 Takara Recombinant DNase I(Clontech Laboratories Inc., CA, USA)로 처리하고 순수 에탄올과 3M 아세트산나트륨을 사용하여 정제했습니다. 추출, DNase 처리 및 정제된 RNA 샘플의 품질은 Take3 Microvolume Plate(BioTek)를 사용하여 분광 광도법으로 평가했습니다. cDNA는 iScript cDNA Synthesis Kit(Bio-Rad Laboratories, CA, USA)를 사용하여 합성했습니다. 정량적 실시간 PCR은 다음의 열 사이클링 조건으로 QuantStudio™ 6 Flex System(Thermo Fisher Scientific, MA, USA)에서 수행되었습니다: 95°C에서 10분간의 초기 핫 스타트, 그 다음 95°C에서 15초간의 변성 40사이클, 60°C에서 1분간의 프라이머 어닐링, 72°C에서 30초간의 연장, 각 연장 단계의 끝에서 데이터를 수집했습니다. 각 PCR에는 Power SYBR™ Green PCR Master Mix(Applied Biosystems™), 10ng cDNA 및 400nM 프라이머가 포함되었습니다. 면역 관련 유전자의 프라이머 시퀀스는 35 에 따라 사용되었으며 표 S1  에 나와 있습니다  . PCR을 완료한 후, 해리 및 융해 곡선 분석을 수행했습니다. 샘플은 기술적으로 3중으로 분석했으며, 데이터는 2 -ΔΔCT  방법 36을 사용하여 계산했습니다 . mRNA 수치는 하우스키핑 유전자  rp49